1材料与方法

1．1材料5种脱氧核苷标准品(2 7一脱氧鸟苷、2 7• 脱氧胸苷、2’．脱氧胞苷、2’一脱氧腺苷、5一甲基-2 7一脱 氧胞苷)(International Laboratory，USA)，DNA提取 试剂盒(德国QIAgen公司)，MTX、核酸酶Pl和 RNA酶(美国Sigma公司)，碱性磷酸酶(Promego公 司)。BECKMAN P／ACETM  MDQ型毛细管电泳仪， 毛细管柱(河北永年锐沣色谱器件公司，60     em×75 pm，有效长度50  cm)，256 nm PDA检测器。32 Kar-als of software  V7．0软件(美国Beckman    Coulter)对数据进行了处理。非小细胞肺癌A549细胞由中国 科学技术大学生命科学院提供。
1．2细胞培养细胞在含10％新生牛血清的RP-MI 1640培养基，5％CO：370C条件下进行孵育培 养。采用浓度递增结合低剂量持续诱导。在对数生 长期的敏感细胞中加入MTX，从15      pLmol／L逐渐加 大至40 I山mol／L。MTX作用24  h后换液，待其恢复 正常生长再提高浓度，如此反复诱导传代，直至细胞 能在1 pLmoL／L  MTX浓度下稳定生长。最终获得耐受MTX为40 pLmoL／L的细胞系，命名为A549／MTX。为保持其耐药性，将其持续在含1 p,mol／L MTX的培养基中培养、传代、冻存。实验前1周撤药，用无药培养基培养。
1．3   MTT法分析采用M，I’I'比色法检测A549和A549／MTX细胞株的细胞活性。取对数生长期的细 胞，洗涤后用10％RPMI 1640调整细胞数为l×105／ml，每孔100山接种于96孔培养板中培养12h，每组设3个复孔，同时设阴性对照和空白对照。12 h后加人不同浓度的MTX再培养48 h，每孔加入 MTT'10山(最终浓度为0．5    ms／rnl)，37℃温育4 h。 每孔加入DMSO 100 m，振荡10 min后，在酶标仪 上波长570／620  nm测定OD值。细胞抑制率=(1 一耐药组平均光密度值／对照组平均光密度值×100％)，确定半数抑制浓度(IC如)。计算耐药指数( resistance  index，RI)，RI(A549／MTX)=IC50(3_549／ MTX)／IC50(A549)。
1．4样品处理取106个细胞，用DNA提取试剂盒提取细胞DNA，200山TE液洗脱，NaAc．无水乙醇法(即加入1／10体积的3    mol／L NaAc，然后加入2．5倍体积无水乙醇，一20℃30    min，12 000 r／rain 离心10  min，弃上清，溶于20“l双蒸水中)浓缩样 本DNA，4℃贮存备。取DNA提取物18出，沸水 浴加热2 rain，立即放至冰上冷却，加4．5—10 mmol／L ZnSO。和7．5山核酸酶P1，37℃水浴孵育16 h，然后加7．5山0．5 mol／L pH 8．3 Tris和4．5一 碱性磷酸酶，37℃水浴2   h，取出上机检测。样本的 甲基化程度可以通过mdC在总的胞苷(dC+mdC) 的百分比，即mdC／(dC+mdC)×100％。
1．5毛细管电泳毛细管为60 em×75斗m(有效长度50  cln)，分离缓冲液为pH   9．6，48  mmol／L的细胞内DNA甲基化水平及变化趋势.碳酸氢钠溶液(含60 mmol／L SDS)、毛细管温度6        7linutes
Minutes25。(3、分离电压20 kV、0．7  psi压力进样5  s，PDA检 测器入=256  nm条件下进行检测。新的毛细管使用 前用0．1 mol／L HCl溶液活化10 min。每次进样前 分别用0．1 mol／L HCl溶液，双蒸水和运行缓冲液 依次冲洗2、2、3 min。每两次进样后更换缓冲液一 次。使用后，分别用0．1 mol／L NaOH和双蒸水各冲 洗5 min，然后将毛细管吹干后保存。
1．6统计学处理使用SPSS 11．0统计学软件，多 组间均数比较采用单因素方差分析，各组间两两比 较应用SNK—q检验。

2结果

2．1    M，rI．法分析非小细胞肺癌A549细胞对 MTX的耐药性MTr法检测结果表明：A549细胞 对MTX的IC∞为(7．99±0．98)la,mol／L，15、30、40 ltmoL／L  MTX诱导耐药t}／1,细胞肺癌A549细胞株 (A549／MTX)对Mrrx的Ic∞分别为(48．1l±2．52)、(75．18±3．56)、(90．35-t-3．24)斗mol／L，耐 药指数(resistant drug index，RI)分别为6．0、9．4、11．3。
2．2毛细管电泳图谱  首先根据上述分离条件对5种脱氧核苷标准品进行毛细管电泳，8     min内可实 现各组分的完全分离(图lA)。通过改变dC和 mdC的量，绘制标准曲线用于样本定量。同等条件 下可实现样本的分离(图1B)，与标准图谱一样，样 本中各组分的重复性和稳定性都较好。
2．3   非小细胞肺癌A549／MTX耐药细胞内DNA甲基化水平取tM,细胞肺癌A549敏感细胞、15、30、40 Iu,mol／L MTX诱导耐药tN,细胞肺癌A549细胞各106个，样本处理后上机检测。同时每组重复4次，每个样本检测3次。不同浓度MTX诱导耐药
图1  A：标准物质图谱dC、mdC、dA、dT和dG各物质的浓度均为0．1 mmol／L；B：样本的电泳图谱分离条件为：pH       9．6，48 mmot／L的碳酸氢钠溶液(含60 mmol／L SDS)、毛细管温度25℃、分离电压20 kV、0．7 psi压力进样时间5   8
表l不同浓度MTX诱导耐药细胞株的甲基化水平检测结果 细胞株              敏感细胞15 iLmol／L  30 p．mol／L 40 txmol／L
DNA甲基化水平4．80％4．20％      3．70％   3．10％
标准差0．52％0．44％0．36％0．35％ 次数                    15           15            15            15
由表1可以看出：多组之间比较采用单因素方 差分析，F=43．808，P<0．001，四组不全相同；各组 间两两比较应用SNK法，四组间两两比较(P<0．01)，四组各不相同，差异有统计学意义。说明 MTX耐药tH,细胞肺癌A549细胞内DNA甲基化 水平较tH,细胞肺癌A549敏感细胞降低，且随着Mrrx耐药浓度增加，MTX耐药tH,细胞肺癌A549细胞内DNA甲基化程度依次降低。MTX耐药程度 与整体DNA甲基化水平呈负相关。即MTX诱导细 胞获得性耐药程度越高，细胞内整体DNA甲基化水 平越低。(责任编辑：南粤论文中心)转贴于南粤论文中心: http://www.nylw.net(南粤论文中心__代写代发论文_毕业论文带写_广州职称论文代发_广州论文网）