1材料与方法
1．1材料SD大鼠由南京医科大学实验动物中心 提供(动物合格证号为普通级scxk苏2002-0031)。 L—DMEM干粉培养基(美国Hyclone公司)；胎牛血 清(杭州四季青生物研究所)；鼠免疫组化染色试剂 盒、DAB显色试剂盒(北京中杉生物技术有限公 司)；5一溴脱氧尿嘧啶(BrdU)、胰蛋白酶(美国Sig- ma公司)；阿托伐他汀(商品名立普妥，剂量20 mg，
大连辉瑞制药有限公司)；BL--420S生物机能实验系
统。
1．2间充质干细胞的获取、培养SD大鼠，体质量
60—100 g，颈椎脱臼处死大鼠，浸泡75％的乙醇中
10 min；无菌条件下剥离股骨和胫骨，剪去股骨和 胫骨两端的骨骺，暴露骨髓腔；用10 IId注射器吸取 培养液冲洗骨髓腔，收集全部骨髓细胞于离心管，
1 200 r／min离心5 min，弃上清液，加L．DMEM完全 培养液重悬细胞并调整密度，接种于培养皿中，置
370C、5％CO：的饱和湿度培养箱中培养。48 h后 换液，以后每3 d更换培养液。细胞基本铺满培养 瓶底面，原代培养完成，0．25％胰蛋白酶室温消化3
～5 rain，1：2传代。间充质干细胞标记：在培养瓶 中加入5一溴脱氧尿嘧啶，终末浓度调至10 i．Lmol／L。 孵育72 h，移植备用。
1．3建立急性心肌梗死模型 成年雄性SD大鼠
280～300 g，称质量后1％水合氯醛(3 ml／kg)麻 醉，气管插管，连接小型人工呼吸机，正压通气辅助 呼吸，潮气量14 lIll，频率70次／min。在左胸前外侧 扪及心跳搏动处竖状切口开胸，持5-0无损伤缝线 于左心耳下缘结扎左冠状动脉前降支。观察前壁心 肌颜色变苍白，心电图相应导联sT段弓背向上抬 高，确认心肌梗死模型建立成功。
1．4实验分组造模成功大鼠分成4组，每组10
只。冠脉结扎30 min后进行移植。对照组：在梗死部位分4个点注射L—DMEM培养液，50∥点。阿
托伐他汀组：梗死部位分4个点注射L．DMEM培养 液，50少点，阿托伐他汀5 mg／(kg•d)溶入生理盐 水2 IIll，灌喂4周。间充质干细胞组：梗死部位分4 点注射已标记的间充质干细胞，每点(50出)2×
106个。联合组：已标记的间充质干细胞注入梗死 部位4个点，每点(50斗1)2 X 106个，阿托伐他汀5 mg／(kg•d)，溶入生理盐水2 ml，灌喂4周。
1．5相关指标检测
1．5．1血流动力学指标测定细胞移植后4周，将 动物麻醉后，沿颈部偏右纵向切开皮肤，在胸锁乳 突肌内侧分离右颈总动脉，将动脉导管经右颈总动 脉插入左室腔内。导管连接生理记录仪。记录左心 室收缩压(LVSP)、左室舒张末期压(LVEDP)、左室
压力变化最大上升速率(+dp／dt一)及下降速率 (一ap／dt一)等指标。
1．5．2免疫组织化学检查 血流动力学测定完成
后，处死大鼠，立即取出心脏，置4％多聚甲醛4℃固 定48 h；常规梯度乙醇脱水，石蜡包埋，制作5斗m 厚连续切片，进行HE染色及BrdU、心肌免疫组织 化学染色。在放大400的光镜下，在以上不同部位 心肌切片中，每处随机抽取5张，每张中随机观察5 处，行细胞计数，将每个视野的细胞数取均数，测得 值即是每个视野中细胞数量心J。
1．5．3免疫组织化学染色细胞移植后4周处死 动物，将心脏取出后，经灌注固定，自肉眼可见梗死 区，梗死周围区及梗死远区(非梗死相关血管供血
区)。分别取组织块，制作石蜡组织块，制作5岬
切片，行特异性免疫组化染色。治疗组与对照组均 行Ⅷ因子免疫组化染色，比较不同组间血管计数：在 放大400的光镜下，在以上不同部位心肌切片中，每 处随机抽取5张。每张中随机观察5处，行血管计 数，将每个视野的血管数取均数，测得值即是每个视 野中血管数量【3J。
1．6统计学处理数据采用SPSS 13．0软件进行
统计分析，以x±s表示，两组间比较采用t检验，多 组间比较采用方差分析。
2结果
2．1间充质干细胞形态观察培养24 h可见短 杆、短梭形间充质干细胞贴壁生长，5 d后可见明显 集落形成，细胞体积增大，多呈梭形。7 d后随着集 落不断扩大，呈漩涡状。随着换液悬浮细胞逐渐被 清除。原代细胞9 d左右达85％以上融合。传代后 细胞以长梭形多见，增殖速度明显加快，平均5 d 达85％以上融合。
2．2大鼠血流动力学检测与对照组相比间充质 干细胞组、联合组、阿托伐他汀组，心功能皆改善，
+dp／dt。，均明显升高，一dp／dt一均明显增加(P<
0．05)；LVSP均明显增加，LVEDP均明显减小(P<
O．05)。联合组较间充质干细胞组和阿托伐他汀组 心功能明显改善(P<0．05)。间充质干细胞组较阿 托伐他汀组组的心功能有改善(P<0．05)(表1)。
2．3大鼠心脏组织学检测对照组、阿托伐他汀组 梗死区心肌纤维化明显，细胞排列紊乱，无新生心 肌细胞。间充质干细胞组、联合组梗死心肌内均可 见5一溴脱氧尿嘧啶阳性移植细胞分布，胞核呈棕 黄绿色(图1)。联合组细胞数量多于间充质干细胞 组[(10．4±1．27)1)5(3．86±1．34)，P<0．05]。
2．4大鼠心脏血管密度检测将心肌组织制成石 蜡切片，并行免疫组织化学染色，在显微镜下观察， 被染成棕黄色的血管即为新生血管(图2)。
阿托伐他汀组、间充质干细胞组、联合组与对照 组相比，血管密度升高(P<0．05)；与阿托伐他汀 组、间充质干细胞组相比，联合组改善程度更明显 (P<0．05)；阿托伐他汀组与间充质干细胞组相比
差别无统计学意义(尸>0．05)(表2)。
3讨论 骨髓间充质干细胞是具有多向分化潜能和自我
表l各组间血流动力学指标的比较(rt=10，；4-s)
b与对照组、a，c比较：P<0．05；c与a比较：P<O．05；c、a与对照组比较：P<O．05
图l 骨髓间充质干细胞Brdn荧光染色X400
A：于细胞组；B：联合组
田2梗死区血管密度 ×400
A：对照组；B：干细胞组；C：阿托伐他汀组；D：联合组
数量表百2各组丽间血而管厂数量莉(个而)指标丽的比嚣较‰(n=1丽0。涵；±而s) 酉(责任编辑：南粤论文中心)转贴于南粤论文中心: http://www.nylw.net(南粤论文中心__代写代发论文_毕业论文带写_广州职称论文代发_广州论文网）
