猕猴桃蛋白质的分离及类型鉴定

来源:南粤论文中心 作者:王岸娜,刘小彦,吴立 发表于:2010-05-07 08:28  点击:
【关健词】猕猴桃;蛋白质;分离;类型鉴定
摘要:用乙醇做提取剂从猕猴桃汁中提取总蛋白,对总蛋白中的蛋白质含量进行了测定,通过 硫酸铵等电点沉淀、透析及Sepharose CL一6B柱层析分离出两种蛋白质,220 nm紫外检测结 合苯酚硫酸法跟踪检测,初步推断两种蛋白质为相对分子质量不同的糖蛋白,分别收集洗脱峰 进行冷冻干燥,得到干粉,测定蛋白质与糖的比值分别为1.156和1.209。红外光谱分析更进 一步验证了两种均为糖蛋白,B一消去反应证明都含有O一糖苷键.


0   前言

猕猴桃属于猕猴桃科(Actinidiacease)猕猴桃 属(Actinidia)的一种落叶性藤本果树.它营养丰 富、食用价值高,尤其是具有一定的医疗保健效 果,因而备受人们重视⋯.现在对其研究非常广 泛,医学研究证实,猕猴桃汁具有阻断致癌性亚硝 基化合物合成的作用;有防癌功能¨一;猕猴桃素 (Actinidin)是从猕猴桃果实中提纯出来的一种类 似木瓜蛋白酶的水解酶,可以嫩化肉类¨1,防止 果冻凝固,药理证明具有抗肿消炎功能;猕猴桃中 还含有大量抗衰老物质超氧化物歧化酶(SOD), 可增强人体免疫功能,增高人血清SOD含量,减 少脂质过氧化物MDA的含量¨1;由于果糖含量 较低,猕猴桃还是糖尿病患者最适宜食用的水果. 国内外关于猕猴桃蛋白质的研究,过去虽然做了 一些工作但一般都是对含量的分析,以及蛋白酶 的简易提纯和性质研究.对猕猴桃蛋白质的类型 还尚未见报道.因此有必要对猕猴桃蛋白质的类 型进行鉴定,为它的应用提供理论依据,并最终推 动整个猕猴桃产业的发展.
本研究采用乙醇做为提取剂,硫酸铵等电点
沉淀、经过透析浓缩得到的样品过凝胶色谱柱进

收稿日期:2009-04-22 基金项目:淮安市科技项目(HAG8058) 作者简介:王岸娜(1972一),女,山西洪洞人。博士,副教授,研究
方向为大分子在食品中的应用.
行分离。运用考玛斯亮蓝和苯酚硫酸法测定糖与
蛋白质的比,并对所得的样品进行红外分析,鉴定
所得蛋白质的类型.

1    材料与方法

1.1材料与仪器 “秦岭”中华猕猴桃:郑州果品批发市场采
购,果实新鲜、饱满,大小相对一致,剔除畸形果、

损伤果和软果;8000—14000透析袋购于北京索莱 宝科技有限公司;Sephrose cL“B购于amersham
公司.
RE2000旋转蒸发器:上海亚荣生化仪器厂; SHB--B95型循环水式多用真空泵:河南巩义市英 峪予华仪器厂;TU—1800pc紫外可见分光光度
计:北京普析通用仪器有限公司;层析柱:上海锦
华层析设备厂;HL一2B数显衡流泵:上海沪西分 析仪器有限公司;Bsz—100自动部分收集器:上 海沪西仪器厂有限公司;pHS一25数显pH计:上 海精密科学仪器有限公司;Delta  326电导率仪:梅 特勒一托利多仪器有限公司;IR--Prestige21型傅
立叶变换红外光谱仪:岛津分析仪器厂制作;
835—50氨基酸自动分析仪:日本Hitachi公司.
1.2    实验方法
1.2.1   猕猴桃蛋白质的提取与定量
将猕猴桃表面擦净,去皮,去籽,榨汁;取果汁
10 mL于三角瓶中,以l:6的料液比加入20%的 乙醇水溶液,在25℃下水浴震荡40 rain.5 000
r/rain离心10 rain,取上清液旋转蒸发除去溶剂,
即得猕猴桃蛋白质粗体液,转移到烧杯中,置于4
℃冰箱保存;从上述总蛋白提取液中取5      mL,考
玛斯亮蓝法”’测得总蛋白质含量.
1.2.2猕猴桃蛋白质的沉淀 采用硫酸铵等电点法沉淀粗体液中的蛋白
质.取100  mL粗体液于7个烧杯中,加入
(NH。):SO。使饱和度达到20%、30%、40%、
50%、60%、70%、80%,所加硫酸铵需用研钵磨成 细粉状,缓慢加入,磁力搅拌器搅拌使硫酸铵完全 溶解;取100 mL粗体液于7个烧杯中,将溶液的 pH值调节至等电点为2、3、4、5、6、7、8.所有的烧 杯4℃静置过夜,5   000 r/rain离心lO   min,测定 上清液中蛋白质含量,计算沉淀率.
1.2.3猕猴桃蛋白质的透析浓缩
沉淀样品装入经过处理的透析袋,留三分之 一至一半的空间,两端用夹子夹紧,于去离子水中 透析.6—8  h更换一次去离子水,并使用磁力搅 拌器搅拌以加快透析速度.用电导率仪测定溶液 的导电率,直到导电率恒定为止.
将透析完毕的透析袋用聚乙二醇(PEG6000) 包埋.浓缩至原来体积的1/2后取出,进行冷冻干 燥,得到固体粉末.
1.2.4猕猴桃蛋白质的分离旧1
上述粉末100 mg复溶于10 mL pH7.5的磷 酸缓冲液中,离心取上清液3   mL上1.6 cm x 100 cm的SepharoseCL--6B柱,磷酸缓冲液(pH=
7.5)为平衡液和洗脱液,流速为15     mL/h,每40
rain收集一管,每管收集10  mL,紫外220 llm跟踪 检测蛋白质的含量,收集洗脱峰,进行透析,浓缩, 然后冷冻干燥得到样品.考玛斯亮蓝测得样品中 蛋白质的含量,苯酚硫酸法测得糖的含量。得出蛋 白质与糖含量比.
1.2.5猕猴桃蛋白质的鉴定
用苯酚一硫酸法"1对凝胶过滤的每一收集管 进行糖量的测定,绘制各收集管的糖含量趋势峰。 比较收集管中蛋白280  nm的吸收峰与糖含量的 高低趋势峰的关系,若二者呈现一致重叠的趋势。 可初步判断糖蛋白的存在"1.为了进一步准确鉴 定糖蛋白,进行红外光谱的分析.
1.2.6红外光谱鉴定蛋白质的类型
取收集得到的两个冻干样品5 mg左右,与
300 mg经干燥的溴化钾粉末在玛瑙研钵中轻轻 研磨均匀,越细越好,在红外灯下操作,以免溴化 钾吸收空气中的湿气.混合好的粉末置于有孔滤
纸中,经压片机压成薄片,随即上机器测定.
1.2.7糖肽键,}生质的分析‘91
分别取猕猴桃蛋白质的两个样品20    mg溶于
5 mL 0.1 mol/LNaOH溶液中,30℃反应20     h,测
定碱处理前后240  nm处氨基酸含量的变化.

2  结果与分析


2.1猕猴桃蛋白质的提取与定量
蛋白质浓度,(Ⅳg•mL-‘)
图l  牛血清蛋白质标准曲线 用考玛斯亮蓝法来对总蛋白提取液定量,考
玛斯亮蓝法是利用蛋白质一染料结合的原理,定
量地测定微量蛋白质浓度的快速、灵敏的方法.本 实验选取Sigma公司纯牛血清蛋白(BSA)制作标 准曲线,用722可见分光光度计测OD值,在本实 验的提取条件下测得蛋白质的提取量为505.470
¨s/mL,每100 mL果汁中蛋白质的提取量为
50.55  mg.
2.2总蛋白质提取液的沉淀(责任编辑:南粤论文中心)转贴于南粤论文中心: http://www.nylw.net(南粤论文中心__代写代发论文_毕业论文带写_广州职称论文代发_广州论文网)

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