(实验研究PI3K/Akt抑制剂联合顺铂治疗肺癌)细胞生存信号的转导对肺癌的发生发展起着至关重要的作用。PI3K/Akt信号转导通路在国外被视为癌细胞存活的首要通路。近年来对Akt的研究发现，Akt能够通过磷酸化其下游的多种作用底物促进对化疗和放疗的抵抗。PI3K/Akt抑制剂LY294002〔2 (4吗琳基)8苯基4氢1苯并毗喃4酮〕可增强某些抗肿瘤药物的疗效，减少化疗抵抗〔1，2〕。而LY294002对肺癌的研究还处于初始阶段，本研究旨在对PI3K/Akt的抑制剂LY294002与化疗药物顺铂（cisplatin，DDP）联用对肺癌细胞株A549及裸鼠移植瘤的生长抑制作用及其机制进行探讨，为肺癌治疗提供实验依据。
1 材料与方法(实验研究PI3K/Akt抑制剂联合顺铂治疗肺癌)
1.1 细胞株与试剂 人肺腺癌细胞株Ａ549购自中科院上海细胞生物研究院；F12K培养基、LY294002及噻唑蓝(MTT)购自sigma公司；胎牛血清购自中国医学科学院生物工程研究所；DDP（云南个旧生物药业有限公司，国药准字@53021740）；裸鼠由北京大学医学院实验动物中心提供。
1.2 细胞培养 A549细胞用F12K培养基，于37℃、5%CO2培养箱内培养。细胞为贴壁生长，0.25%胰蛋白酶消化传代。
1.3 MTT比色分析法 检测LY294002对A549细胞生长抑制作用。取对数生长期Ａ549细胞按1×104/孔接种于96孔培养板，每孔加液量200 μl。于培养24 h后换液，设空白调零组(不接种细胞)、对照组(只含等量溶剂)及实验组(加不同浓度的DDP，DDP浓度依次为0.5、1、2、4、8、16 μg/ml，每组LY294002终浓度分别为20 μmol/L)，每组设6个复孔。于培养48 h后加入MTT(5 g/Ｌ)20 μl，继续培养4 h后吸出上清，每孔加二甲基亚砜（DMSO）150 μl，振荡溶解10 min，待结晶完全溶解后，在酶联免疫测定仪上选择波长490 nm，空白孔调零，测定各孔吸光度Ａ。计算细胞生长的抑制率，抑制率=(1-实验组Ａ平均值/对照组Ａ平均值)×100%。
1.4 流式细胞仪检测细胞周期及凋亡率的变化 取对数生长期的A549细胞，调整细胞浓度为2×105/ml接种于培养瓶，加入上述不同浓度的药物（LY294002终浓度为20 μmol/L， DDP终浓度别为3 μg/ml），培养48 h后获取细胞，制成单细胞悬液， 4℃ 70%冷乙醇固定，放置4℃冰箱固定12 h以上。检测时，弃去乙醇，加入0.5%胃蛋白酶1 ml（pH值 1.5～2.0）消化，采用碘化丙锭（PI）一步插入性DNA定量荧光染色法，上机检测细胞周期和细胞凋亡率。(实验研究PI3K/Akt抑制剂联合顺铂治疗肺癌)
1.5 裸鼠移植瘤模型的建立与干预 24只裸鼠，均为雌性，鼠龄为3～4 w，体重约18～20 g，实验和饲养均在无特定病原（SPF）条件下进行。随机将裸鼠分为4组：对照组、LY294002组、DDP组和LY294002+DDP组，每组6只，于裸鼠右上背部皮下接种对数生长期的A549细胞1×107/0.2 ml。待1 w后肿瘤长出。①LY294002组：给予LY294002 25 mg/kg，腹腔注射，每周2次；②对照组：等量生理盐水，腹腔注射；③DDP组：给予DDP 4 mg/kg，腹腔注射；④LY294002＋DDP组： LY294002 25 mg/kg＋DDP 4 mg/kg，腹腔注射；共3 w。裸鼠于最后注射药物2 d后处死，用药3 w。实验中注意观察裸鼠精神、进食、排便及体重情况，隔日测裸鼠体重及移植瘤直径。实验结束取出移植瘤，注意肿瘤转移情况，称重瘤结节，计算抑瘤率：抑瘤率（％）＝（对照组瘤结节重量-各实验组瘤结节重量）/对照组瘤结节重量×100％。取LY294002组及LY294002＋DDP组裸鼠肝、胃及肠做HE染色。
1.6 统计学方法 计量资料用x±s表示，用SPSS13.0统计软件行单因素方差分析和Pearson相关分析，率的比较采用χ2检验。
2 结果(实验研究PI3K/Akt抑制剂联合顺铂治疗肺癌)
2.1 LY294002联合DDP对A549细胞生长的抑制效应 MTT结果显示：LY294002浓度分别为5、10、20、40 μmol/L时，其抑制率分别为：26.94％、34.33％、42.53％、49.88％，可见在一定的浓度范围内，随着LY294002剂量的增加，其抑制率增加。根据LY294002对A549细胞的抑制效应选用LY294002浓度为20 μmol/L 作为与DDP联合的干预浓度。见表1。
由表1可以看出：DDP单用时，浓度达1 μg/ml可显示抑制A549细胞的增殖，抑制率为11.41％，各浓度组与对照组相比差异均有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）；随着浓度的增大，抑制作用增大，呈剂量效应关系（r＝0.808，P＜0.05）。LY294002与DDP联用时，DDP浓度为0.5 μg/ml即可显示出抑制A549细胞的增殖，抑制率为9.65％。各浓度组与对照组相比差异均有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。LY294002+DDP各浓度组与DDP单独作用对应各浓度组相比，DDP浓度为0.5 μg/ml和1 μg/ml时，抑制率的差异有统计学意义（P＜0.05）。当DDP浓度再增加，各药物联合组抑制率与DDP单用组相比，有增高的趋势，但其差异无统计学意义（P＞0.05)。低浓度组，药物联合组抑制率与DDP单用组相比，差别较大，DDP浓度越高，其差别越小。(责任编辑：南粤论文中心)转贴于南粤论文中心: http://www.nylw.net(南粤论文中心__代写代发论文_毕业论文带写_广州职称论文代发_广州论文网）
