结肠腺癌是常见的消化道恶性肿瘤之一，发病率、死亡率均居恶性肿瘤的前列，且有逐年上升的趋势。1974年Morson提出了大肠癌发生的“腺瘤-癌”顺序，这一观点已逐步得到认可[1]。有研究证实80%以上的结肠癌是由结肠腺瘤恶变而来[2-3]。流行病学、病理学以及临床研究等均说明大肠腺瘤为大肠癌主要的癌前病变。
　　Syndecan-1是硫酸乙酰肝素蛋白聚糖家族中的成员，能与许多对血管发生与修复、免疫细胞生长、细胞-细胞/细胞-细胞外基质间粘附起调节作用的配体如生长因子、细胞因子、趋化因子和细胞外基质等相互作用，从而在形态发生、组织修复、宿主防御、能量代谢中发挥重要作用[4-5]。研究发现Syndecan-1在人类多种恶性肿瘤组织表达显著降低[6-7]。笔者就syndecan-1在结肠腺瘤及腺癌组织中的蛋白及RNA水平的表达及意义进行研究，现报道如下。
　　1 材料与方法
　　1.1 标本来源 腺瘤及腺癌组织标本取自2010-2011年广州市番禺区中心医院消化内科内镜活检组织，所有标本均经病理证实。正常组织取自肠易激综合征患者（均知情同意），肠镜检查为正常肠道。48例腺瘤患者中男30例，女18例，年龄33～75岁，平均51岁。32例结肠癌患者中男21例，女11例，年龄42～80岁，平均56岁。
　　所取标本为两部分，一部分取材后即刻置于4%多聚甲醛固定，另一部分即刻置于标本保存液中，3 h内转移至-80 ℃低温冰箱冻存。
　　1.2 实验试剂 小鼠抗人syndecan-1（CD138）多克隆抗体由南方医科大学消化内科陈烨教授惠赠。小鼠抗人免疫组化检测试剂盒（SP-9002试剂盒，购自北京中杉生物技术有限公司），DAB显色试剂盒（购自北京中杉金桥公司），TRIZOL 反应剂（购自Invitrogen公司）。
　　1.3 免疫组织化学方法检测syndecan-1 采用免疫组织化学SP法，所有标本进行常规石蜡包埋，切片（4 μm）后脱蜡并水化，于PBS溶液中进行微波抗原修复；采用3%过氧化氢阻断内源性过氧化物酶15 min；正常山羊血清封闭，室温30 min；滴加山羊抗小鼠syndecan-1多克隆抗体（1：600），4 ℃过夜。滴加生物素标记的IgG抗体（二抗）和链霉卵白素三抗，DAB显色2 min，进行苏木素复染，氨水返蓝，烤干后封片，置于显微镜下观察。
　　1.4 免疫组化结果分析 采用半定量积分法，凡细胞浆内或核膜上呈棕黄色者为阳性，根据染色强度和显色细胞的比例进行综合评分。（1）按组织显色深浅评分：无显色者为0分，呈浅黄色或黄色者为1分，呈棕黄色者为2分，呈棕褐色者为3分。（2）以细胞着色比例分级为：<25%的细胞着色，计0.1分；26%～50%的细胞着色，计0.4分；51%～70%的细胞着色，计0.6分；71%～100%的细胞着色，计0.9分。（3）每张切片的积分为（1）×（2）。
　　1.5 syndecan-1 mRNA逆转录--聚合酶链式反应分析 用TRIZOL反应剂从20～100 mg肠黏膜中提取总RNA。将3 μg RNA置于10 μL逆转录反应系中转录为cDNA。采用Random 9 mers 引物和AMV进行逆转录并行PCR扩增，扩增反应条件：预变性94 ℃，10 min，变性94 ℃，45 s，退火63 ℃，1 min，延伸72 ℃，1 min，35个循环，延伸72 ℃，10 min。引物GAPDH上游：5’-CCATGGAGAAGGCTGGGG-3’；GAPDH下游：5’-CAAAGTTGTCATGGATGACC-3’（197 bp）；syndecan-1上游：5’-tcaccttgtcacagcagacc-3’；syndecan-1下游：5’-tctgtgtggggagtgtgaag-3’（379 bp）。取1/10扩增产物在10 g/LTBE琼脂糖胶用溴化乙啶显影，用凝胶成像系统及图像分析软件进行成像及分析。
　　1.6 统计学处理 采用SPSS 13.0软件，计量资料以（x±s）表示，对正常肠道黏膜、腺瘤及腺癌之间的比较结果进行oneway-ANOVA方差分析及非参数检验，对腺癌的临床资料进行两样本的t检验，P<0.05为差异有统计学意义。
　　2 结果
　　2.1 syndecan-1 mRNA表达检测结果 使用Image-Pro Plus 6.0软件对RT-PCR条带进行半定量，目的条带灰度值/内参条带灰度值=IOD比值，以此来表示Syndecan-1mRNA的表达水平。正常肠道黏膜的syndecan-1 mRNA呈高表达，腺瘤中syndecan-1的表达量明显降低，在腺癌组织中syndecan-1 mRNA呈低表达，三者之间差异均有统计学意义（P<0.05），见图1、图2。
　　2.2 syndecan-1蛋白表达检测结果 免疫组化染色中可见，syndecan-1蛋白主要着色于黏膜基底侧、腺体上皮，以及间质中的浆细胞胞膜。绝大多数正常肠道黏膜上皮细胞的胞膜和胞浆可见大量棕黄色颗粒，腺瘤中亦可见较多的棕黄色颗粒，腺癌腺上皮细胞中只有少量或者几乎检测不到syndecan-1蛋白的表达。在所有正常组织、腺瘤和肿瘤组织的切片中，细胞间质均有着色，浆细胞的胞膜染色均呈阳性，肿瘤组织的细胞间质也存在浅着色。对免疫组化半定量积分进行统计分析，腺瘤中syndecan-1蛋白的表达较正常组织有明显下降（P=0.001），但明显强于腺癌（P=0.034）。见图3、图4。 　正常肠道黏膜（SP×200）
　　腺瘤（SP×200）
　　腺癌（SP×200）
　　3 讨论
　　硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（heparan-sulfate proteoglycans，HSPGs）是位于细胞表面的一种糖类聚合物，由一个核心蛋白和一条或多条硫酸类肝素链共价结合而成，能够影响多种分子、细胞类型及炎症的相关进程。HSPGs主要有3个亚家族，其中Syndecan家族是一族跨膜蛋白聚糖，是主要的细胞表面HS。Syndecan家族有4个成员，分别为Syndecan-1、-2、-3、-4，目前以对Syndecan-1的研究最广泛、最深入。
　　Syndecan-1常表达于细胞膜，其HS链具有广泛的结构异质性，可结合细胞外基质（extracellular matrix，ECM）活性分子、细胞表面粘附分子、酶等，将细胞微环境成分与细胞骨架联接起来。Syndecan-1的功能主要有：（1）隔离保护生长因子等免被蛋白酶降解，并协调其与相应受体的结合；（2）与ECM结合，增强细胞粘附；（3）以共受体的方式调节细胞与微环境之间的相互作用，参与血管形成、组织器官分化发育、组织再生等一系列生理过程的调节[8]。Syndecan-1作为肿瘤细胞与肿瘤微环境成分之间交流的一种桥梁，在肿瘤细胞分化、增殖、侵袭转移、血管生成等过程中起重要作用。
　　笔者通过免疫组化及RT-PCR，分别从蛋白水平及mRNA水平验证了Syndecan-1核心蛋白在正常肠道黏膜中广泛表达，而在腺瘤中表达减少，在腺癌细胞中，其表达的缺失也最为明显，三者之间Syndecan-1的表达差异具有显著性。此结果与国外的研究发现基本是一致的[9]。Day等[10]报道：Syndecan-1的表达在结肠腺瘤向腺癌转变的过程中出现了缺失。晚期的大肠肿瘤进一步发展的时候，肿瘤细胞和（或）基质细胞释放蛋白水解酶增加，使硫酸乙酰肝素由Syndecan-1上脱落，可能因此而导致了这些失去了硫酸乙酰肝素链的无功能型分子的降解。这也可能解释了与结肠腺瘤相比，Syndecan-1的表达在结肠癌中显著降低的原因。另外，肝素结合的生长因子可调节细胞的生长和分化，并可通过HSPG家族与其具有高亲和性的信号传导受体相结合，Syndecan-1则被认为参与了该过程[11-12]。通过转染技术对Syndecan-1的研究亦揭示了其高表达可导致生长因子应答的下调[13]，提示Syndecan-1的强表达与对过度生长的抑制密切相关。 (责任编辑：南粤论文中心)转贴于南粤论文中心: http://www.nylw.net(代写代发论文_毕业论文带写_广州职称论文代发_广州论文网）