恶性肿瘤是目前威胁人类健康的主要疾病之一，其发病率和死亡率呈现逐年上升的趋势。如何开发出安全有效的抗肿瘤药物新制剂，改善患者的生活质量仍是当前医药学家亟待攻破的难题之一。研究表明过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活子-1α（peroxisome proliferator-activated receptor-γ coactivator-1α，PGC-1α）是近年发现的一种新型辅助转录激活因子，与肿瘤细胞的凋亡及其能量代谢的生理功能密切相关，可能是新的抗肿瘤药物作用生物标志物^[1]。 PGC-1α在肿瘤组织中表达水平明显降低，肿瘤的恶性程度越高，降低的程度就越明显。PGC-1α与机体能量代谢存在着密切关系，药物诱导PGC-1α的表达可以促使肿瘤细胞的凋亡^[1]。
　　通过查干嘣嘎对PGC-1α的活性调控研究，筛选与能量代谢相关的抗肿瘤作用有效成分，对于寻找新靶点抗肿瘤制剂具有重要的研究意义。查干嘣嘎是蒙药中的常用药物^[2]，也是传统中药中的一种，中药名为附子。附子为毛茛科乌头属植物乌头Aconitum carmichaeli Debx.的子根，始载于《神农本草经》，为大热、有毒，具有回阳救逆、补火助阳、散寒止痛之功效^[3]。现代药理研究表明，附子具有抗炎、镇痛、强心、抗心律失常、降血糖、抗癌、对心血管系统和对神经系统作用等^[4]。
　　PGC-1α参与线粒体的多种生物功能并共激活调控核受体和转录因子的活性。在能量需求旺盛，氧化代谢活跃的组织中表达丰富，调控适应性产热和刺激线粒体的生物合成。选取KM及C57BL/6小鼠与能量代谢密切相关的主要组织器官，以PGC-1α为靶标，研究查干嘣嘎总提取物在正常小鼠体内对PGC-1α mRNA表达水平的影响；同时考察查干嘣嘎总提取物对A549非小细胞肺癌细胞株的PGC-1α mRNA表达水平的影响。
　　1 材料
　　1.1 动物 KM和C57BL/6健康雄性小鼠，体重20～22 g，SPF 级，由南京大学生命科学院动物实验中心提供。
　　1.2 细胞 A549非小细胞肺癌肿瘤细胞株由南京大学生命科学院提供。
　　1.3 药品与试剂 查干嘣嘎（中药附子）的炮制品（生产批号100915-3）购自南京药业股份有限公司；HO-βCD（鲁药准字F2012004）由淄博千汇生物科技有限公司提供；TRIzol RNA提取试剂（货号15596-026）和cDNA合成试剂盒（批号BK1001），Perfect Real-time-SYBR Premix EX TaqTM试剂盒（批号BKA3102）由宝生物工程（大连）有限公司产品；引物由上海生工生物工程技术公司合成：PGC-1α的上游引物 （5′-3′）CCCGTGGATGAAGACGGATTG，下游引物为（5′-3′）GTGGGTGTGGTTTGCTGCATG；内参GAPDH的上游引物为（5′-3′）TGTGTCCGTCGTGGATCT，下游（5′-3′） CCTGCTTCACCACCTTCTTGA。
　　1.4 仪器 Roche LightCycler 480实时荧光定量 PCR（ 瑞士罗氏公司），applied biosystems 2720 PCR仪（美国AB公司），Infinite M200 PRO酶标仪（奥地利TECAN公司），Thermo Forma 900 SERIES -86 ℃超低温冰箱（美国THERMO Electron公司），Thermo LEGEND MICRO 17R 1.5 mL低温离心机（美国 THERMO Electron 公司），Thermo C Multi-Fuge X 1R 50 mL 低温离心机（美国THERMO Electron公司），Thermo Scientific FORMA DIRECT HEAT CO2 incubator（美国 THERMO Electron 公司），旋转蒸发仪RE-52AA旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂），LGJ-10D冷冻干燥机（北京四环科学仪器厂有限公司）。
　　2 方法
　　2.1 药材提取 称取查干蹦嘎药材约110 g，加入到1 L的圆底烧瓶中，再加入600 mL的70%乙醇溶液，加热回流提取。提取2次， 每次3 h。合并2次药材提取液，用旋转蒸发仪浓缩成稠浸膏。冷冻干燥得干浸膏，装入50 mL的离心管密封备用。
　　2.2 提取物溶液的准备 制备灌胃溶液，称取约4.0 g HO-βCD 高分子材料，室温条件下，去离子水将其溶解至浓度为4%，0.22 μm微孔滤膜过滤，2～4 ℃保存备用；精确称取查干嘣嘎总提取物，加4%的HO-βCD溶液超声10 min，于60 ℃水浴加热溶解，补足体积使总浓度为10 g·L^-1，2～4 ℃贮存备用。

      　2.3 动物试验 分别选择KM和C57BL/6J雄性小鼠各12～18只，8～10周龄。按随机分组的方法分成2组，每组6～9只小鼠，分别为KM生理盐水组，KM查干嘣嘎总提取物组，C57BL/6J生理盐水组，C57BL/6J查干嘣嘎总提取物组。给药前后，小鼠无禁食禁水。
　　小鼠适应环境1周，灌胃给药。查干嘣嘎总提取物剂量为50 mg·kg^-1，每天早上9：30给药，连续给药4 d，第5天早上9：30给药，2 h之后分别处死生理盐水组和查干嘣嘎给药组小鼠，快速切取肺部组织，冷冻液氮里面保存备用。
　　2.4 细胞试验 将人非小细胞肺癌（A549）接种到6孔细胞培养板中，置二氧化碳培养箱中于37 ℃、相对湿度95%的条件下孵育24 h，待细胞贴壁生长。药材提取物用DMSO溶解，然后用PBS稀释，将化合物稀释溶液加入到孵育的24孔细胞培养板中，使药材提取物的最终浓度为2及20 mg·L^-1，且保证DMSO在孵育体系中的浓度小于1%；空白对照组，加入生理盐水。加入药物培养4 h或8 h之后，吸去上清，PBS轻轻洗涤，弃上清。加入Trizo RNA提取液，提取细胞里面的PGC-1α mRNA 备用。
　　2.5 动物组织中RNA的提取 取液氮中冷冻的动物组织0.1～0.2 g置于组织匀浆器中，加入预冷的Trizol液1 mL 于玻璃匀浆器中，在冰浴中迅速匀浆15～30 s，以充分研碎组织。然后将悬浮液吸入另一1.5 mL Ep管中，于室温条件下静置5 min；加入200 μL氯仿，剧烈振摇15 s混匀后，室温静置3 min；4 ℃，1万r·min^-1离心15 min，RNA分布于水相中；将上层无色水相转移到另一Ep管中，加入500 μL 异丙醇，室温静置10 min；4 ℃，1万r·min^-1离心10 min；弃上清液，用1 mL 75%乙醇洗涤RNA沉淀物，4 ℃，7 500 r·min^-1离心5 min；弃上清液，室温干燥15 min；向干燥过的沉淀物中加入200 μL DEPC处理水溶解沉淀物，于-20 ℃保存备用。
　　2.6 RT-PCR实验 加入2 μL dNTP mixture，2 μL oligo（dt） primer，10 μL总RNA提取物，6 μL Depc H2O于PCR 96孔板；反应温度65 ℃ 5 min， 4 ℃ 5 min，离心30 s；上述变性，退火后反应液中加入8 μL的5×Prime script Buffer，1 μL RNase inhibitor，1 μL Primer script Rtase，10 μL Depc H2O；反应温度42 ℃ 30 min，72 ℃ 15 min，降温至4 ℃；得到cDNA备用。 (责任编辑：南粤论文中心)转贴于南粤论文中心: http://www.nylw.net(代写代发论文_毕业论文带写_广州职称论文代发_广州论文网）

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