(相关蛋白及cmyc、cfos mRNA在糖尿病大鼠心肌细胞中表达的研究 )糖尿病心肌病是一种特殊类型的心肌病，凋亡在糖尿病心肌病变中起关键作用，糖化血清白蛋白能够增加早期反应基因cfos水平〔1～3〕，cmyc具有促进细胞凋亡的作用，cfos具有双重作用。但目前关于糖尿病心肌病变中cmyc、cfos mRNA及蛋白表达的报道较少，表达水平有无改变有待进一步阐明。本文着重探讨糖尿病状态下心肌细胞增殖和凋亡相关基因cmyc、cfos mRNA表达水平变化，及cmyc、cfos 相关蛋白水平的变化，探讨糖尿病大鼠心肌发生凋亡的分子生物学机制，为糖尿病心力衰竭的防治提供理论依据。
1 材料与方法(相关蛋白及cmyc、cfos mRNA在糖尿病大鼠心肌细胞中表达的研究 )
1.1 动物 8周龄雄性清洁级SD大鼠50只，体重200～220 g，由河北医科大学实验动物中心提供（合格证编号：903200）。随机分为对照组（15只）及糖尿病组（35只）。对照组应用普通饲料喂养（碳水化合物65.5%，脂肪10.3%，蛋白质24.2%），糖尿病组应用高脂饲料喂养（碳水化合物20.1%，脂肪59.8%，蛋白质20.1%）。
1.2 方法
1.2.1 仪器与试剂 低温冰箱（日本SANYO公司），GHK2FGS显微镜（日本Olympus公司），制冰机（日本SANYO公司），血糖/血酮仪OptiumTM（美国强生公司），低温高速离心机HITACHI20PR52D（日本东芝公司），HM315组织切片机（德国Walldorf公司），Humalyzer半自动生化仪（德国豪迈公司），光镜照相机MICRODPHOTFXA（日本Nikon公司）。链脲佐菌素（STZ，德国SERVA公司），RT试剂盒（Fermentas公司），PCR试剂盒（ Promega公司）。(相关蛋白及cmyc、cfos mRNA在糖尿病大鼠心肌细胞中表达的研究 )
1.2.2 模型制备 参照文献〔4～6〕方法建立2型糖尿病(T2DM)大鼠模型。两组大鼠饲养8 w后，对照组及糖尿病组各随机抽取5只大鼠，通过空腹血糖测定、口服糖耐量试验（OGTT）、空腹胰岛素水平（FINS）、胰岛素抵抗指数（IRI）及血糖钳技术证实糖尿病组大鼠产生了胰岛素抵抗。其余20只糖尿病组大鼠禁食12 h后一次性腹腔内注射小剂量2%STZ 25 mg/kg，注射72 h后尾静脉采血，测定禁食6 h后的空腹血糖，血糖＞7.8 mmol/L为2型糖尿病大鼠模型，继续用高脂饲料喂养6 w。
1.2.3 检测指标 动物饲养8 w，空腹12 h后，用50％葡萄糖灌胃(2 g/kg)，割尾取血，用OptiumTM血糖/血酮仪按常规快速测定仪检测0、30、60、120 min血糖。FINS采用竞争性放射免疫分析法测定，放射性125I胰岛素同样品中的胰岛素抗体竞争反应，按常规操作进行。正葡萄糖钳夹实验测定胰岛素敏感性，记录稳态下连续120 min的葡萄糖输注速率。取稳态下6 次葡萄糖输注速率的平均值作为稳态葡萄糖输注速率〔GIR， mg/(kg·min)〕，反映机体对胰岛素的敏感性。参照文献〔7，8〕方法，依据公式〔IRI=(FBG×FINS)/22.5〕计算IRI值。(相关蛋白及cmyc、cfos mRNA在糖尿病大鼠心肌细胞中表达的研究 )
1.2.4 cmyc、cfos mRNA表达的测定 14 w时，大鼠禁食12 h，次日6 ml/kg乌拉坦腹腔注射麻醉，迅速打开胸腔取出心脏，剪去血管和心脏周围结缔组织，用4℃预冷生理盐水冲洗，立即置于液氮中，分装后-80℃冻存，用于提取总RNA。用Trizol法提取总RNA，应用上海生工生物工程公司的PCR引物：cmyc（GenBank：AY679730）：上游：5′CTTCCCCTACCCGCTCAACGAC3′，下游：5′CACATCAATTTCTTCCTCATCA3′，扩增产物长度为208 bp；cfos(GenBank:X06769)：上游：5′CTTCCTTTGTCTTCACCTACCC3′，下游：5′GGCTCACATGCTACTAACTACC3′，扩增产物长度为439 bp；GAPDH(GenBank:AF106860)：上游：5′ACATCATCCCTGCATCCACT 3′，下游：5′GGGAGTTGCTGTTGAAGTCA 3′，扩增产物长度为650 bp。以GAPDH作为内参照，以RTPCR方法检测cmyc、cfos mRNA的相对表达量。
1.2.5 cmyc、cfos蛋白的测定 应用蛋白质提取液提取心肌组织中的总蛋白，以βactin作为内参照，采用Western印迹方法测定cmyc、cfos蛋白的变化。
1.3 统计学处理 所有数据均用x±s表示，采用SPSS 13.0软件进行统计学处理分析，对所测定结果进行正态性及方差齐性检验，组间比较用单因素方差分析检验。
2 结果(相关蛋白及cmyc、cfos mRNA在糖尿病大鼠心肌细胞中表达的研究 )
2.1 一般情况 对照组大鼠进食饮水状况、日常活动、精神状态等正常。糖尿病组大鼠体重明显增加，呈现腹型肥胖，8 w时明显重于对照组。注射STZ后，体重下降，但至14 w时，体重仍然重于对照组。糖尿病组大鼠在注射STZ后1 w内出现多食、多饮、多尿症状，并逐渐加重，毛发干枯，色泽晦暗，反应迟缓，活动量明显减少。
2.2 体重及FINS、FPG、ISI水平 见表1～表5。8 w时，OGTT试验糖尿病组各个时间点血糖值均高于对照组（P＜0.05）。糖尿病组大鼠体重和血糖钳GIR与对照组比较有显著性差异（P＜0.05），体重增加，GIR明显减低，表明糖尿病组大鼠出现明显的胰岛素抵抗。糖尿病组空腹FINS、FBG、ISI明显高于对照组（P＜0.05）。注射STZ后72 h，空腹血糖糖尿病组大鼠显著高于糖尿病组注射STZ前(P＜0.01)。14 w时，糖尿病组大鼠体重和空腹血糖高于对照组（P＜0.05）。(责任编辑：南粤论文中心)转贴于南粤论文中心: http://www.nylw.net(南粤论文中心__代写代发论文_毕业论文带写_广州职称论文代发_广州论文网）
