1.6.6 转基因BDC T细胞IL?17的表达 筛选后的Thy1.1+/Thy1.2+的携带IL?17的BDC T细胞和携带siRNA?IL?17的BDC T细胞给予培养液或培养液加anti?α?CD3和anti?α?CD28单克隆抗体(0.5 μg/ml)共刺激培养24 h后收获，检测细胞上清IL?17表达水平。按照IL?17 ELISA试剂盒说明进行。
1.7 统计学分析 采用SPSS11.0统计软件分析，数据以x±s表示，组间比较采用单因素方差分析。
2 结果(siRNA?IL?17和IL?17基因逆转录病毒载体的构建及其转染致糖尿病性T细胞中IL?17的表达)
2.1 含IL?17或siRNA?IL?17的逆转录病毒载体的构建及鉴定 IL?17 PCR产物与pGEM T载体连接，通过Sal I和BglⅡ双酶切重组质粒pGEM?IL?17和MIT?Thy1.1，在T4连接酶的协助下，连接IL?17和MIT?Thy1.1。阳性克隆筛选后，大量提取阳性克隆，再次进行双酶切验证。阳性克隆经Sal I和BglⅡ双酶切，成为两个片段，即6 000 bp大小的MIT?Thy1.1病毒载体和510 bp大小的IL?17片段，见图1。在T4连接酶作用下，U6?siRNA?IL?17在StuⅠ位点插入pMND?BANSHEE?Thy1.1质粒，经XhoⅠ和Hind Ⅲ酶切，阳性的pMND?BANSHEE?Thy1.1重组质粒可出现3个片段，分别是5 338 bp，789 bp和565 bp，而没有携带U6?siRNA?IL?17目的基因的空载体在酶切后也出现3个片段，即5 338 bp，789 bp和185 bp，见图2。
1：MIT空载质粒；2：MIT?IL?17重组质粒； M：1kb DNA Marker
图1 Sal I和BglⅡ双酶切鉴定MIT?IL?17质粒电泳图（略）
2.2 Phoenix包装细胞的鉴定 抗体染色和流式细胞学鉴定转导前Phoenix细胞呈Thy1.1阴性，转导后，MIT空载体、重组Bcl?2?MIT质粒、重组IL?17质粒和siRNA?IL?17质粒的转导率增加，分别是(96.1±4.2)%，(93.2±2.2)%，(93.5±3.2)% 和(89.5±4.7)%，与空白对照组(0.4±0.1)%相比，差异均有统计学意义(P<0.01)。
2.3 BDC T细胞活化度的鉴定 分别用CD4/CD69和CD4/CD62L〔3〕抗体标记活化前、后的脾细胞，与活化前比较，活化后BDC T细胞比例增加，活化前、后CD4+/CD69+细胞和CD4+/CD62L-细胞的比例分别由(3.4±1.5)%和(8.6±2.8)%提高至(33.7±6.9)%和(25.5±5.3)%，提示CD4+细胞处于较理想的被转染状态。
2.4 转基因BDC T细胞的鉴定 在Mock空白对照组、MIT空载体组，Bcl?2阳性对照组、IL?17组和siRNA?IL?17组中，Thy1.1+/Thy1.2+细胞比例分别为(0.6± 0.3)%，(7.2± 2.4)%，(6.8±2.6)%，(6.4±2.4)%和(4.6±1.8)%。
2.5 转基因BDC T细胞的筛选和鉴定 以Thy1.1、Thy1.2和BDC2.5 TCR抗体标记被筛选的细胞，并进行流式细胞学分析显示：①经Thy1.2和BDC2.5 TCR抗体标记证实被筛选的细胞是BDC2.5 T细胞，②与筛选前对比，Thy1.1和Thy1.2抗体标记的双阳性IL?17转基因细胞从(5.1±2.4)%提高到(97.2±1.2)%，siRNA?IL?17转基因细胞从(4.6±1.6)%提高到(83.2±6.3)%，见图3,4。(siRNA?IL?17和IL?17基因逆转录病毒载体的构建及其转染致糖尿病性T细胞中IL?17的表达)
2.6 转基因BDC T细胞的IL?17的体外表达 非活化组和活化组的IL?17转基因T淋巴细胞的IL?17的表达〔(172.17±22.52)，(309.19±33.87) pg/ml/5×105细胞〕均显著高于siRNA?IL?17转染组〔(5.10±7.21)，(6.67±9.44) pg/ml/5×105细胞〕和对照组〔(64.32±6.38)，(4.64±1.28) pg/ml/5×105细胞〕(均P<0.01)，其中活化组的IL?17的表达较非活化组更高(P<0.01)；siRNA?IL?17转染组的IL?17的表达较IL?17转染组显著减低(P<0.01)，且与对照组无显著性差异(均P>0.05)。
1：pMND?BANSHEE?Thy1.1空载质粒；2～4：pMND?BANSHEE?Thy1.1?U6?siRNA?IL?17重组质粒；M：1kb DNA Marker
图2 XhoⅠ和Hind Ⅲ双酶切pMND?BANSHEE?Thy1.1重组质粒电泳图（略）
Retro IL?17:携带IL?17的逆转录病毒转染的BDC T细胞；Retro siRNA?IL?17：携带siRNA?IL?17的逆转录病毒转染的BDC T细胞
图3 转基因BDC T细胞筛选前后流式细胞学分析图4 转基因BDC2.5 T细胞筛选后鉴定（略）
3 讨论(siRNA?IL?17和IL?17基因逆转录病毒载体的构建及其转染致糖尿病性T细胞中IL?17的表达)
Thy1.1在本研究中作为逆转录病毒转导过程中的细胞表面标志而存在。虽然Thy1.1与其等位基因编码的抗原Thy1.2仅有一个氨基酸序列的差别，但其细胞表达上却有很大差别，生理情况下，Thy1.1多表达在胸腺细胞、脑、脊髓、骨髓细胞和其他非淋巴细胞如乳腺上皮细胞表面，而Thy1.2则是胸腺来源的外周淋巴细胞的表面标志。因此，以Thy1.1作为外来基因转导的表面标志，以Thy1.2作为胸腺来源的CD4细胞的表面标志符合实验设计。再者，与常用的表面标志GFP相比，Thy1.1可以更长时间的表达于活化的T细胞中〔4〕。(责任编辑：南粤论文中心)
